HPLC法測定脂溶性維生素，

實驗原理：

樣品中的維生素A 及維生素E 經皂化處理后，將其不可皂化部分提取至有機溶劑中。用液相色譜法C18反相柱將維生素A 和維生素E 分離，經紫外檢測器檢測，并用內標法定量測定。該法zui小檢出量分別為：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng.
三、儀器和試劑
儀器
高壓液相色譜儀帶紫外分光檢測器、旋轉蒸發(fā)器、高速離心機；小離心管：具塑料蓋1.5~3.0mL塑料離心管（與高速離心機配套）、高純氮氣、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計。
2.試劑
實驗用水為蒸餾水。試劑不加說明為分析純。
1.無水yi醚：重蒸，不含有過氧化物。
過氧化物檢查方法：用5mL yi醚加1mL 10%碘化鉀溶液，振搖1min。如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍色。
去除過氧化物的方法：瓶中放人純鐵絲或鐵沫少許，重蒸yi醚。棄去10%初餾液和10%殘餾液。
2.無水乙醇：重蒸，不含有醛類物質。
檢查方法：取2mL 銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應則表示乙醇中有醛。
銀氨溶液：加氨水至5%銀溶液中，直至生成的沉淀重新溶解為止，再加10%氫氧化鈉溶液數(shù)
滴，如發(fā)生沉淀，再加氨水直至溶解。
脫醛方法：將2g 銀溶于少量水中，4g 氫氧化鈉溶于溫乙醇中，然后將兩者傾入1L 乙醇中，振搖后，放置暗處兩天（不時搖動，促進反應），過濾，置蒸餾瓶中蒸餾，棄去初蒸出的50mL。當乙醇中含醛較多時．銀用量適當增加。
3.無水鈉。
4.甲醇：色譜純或分析純重蒸后使用。
5.重蒸水：蒸餾水中加少量高錳酸鉀，臨用前重蒸。
6.10%抗壞血酸溶液（W/V）：臨用前配制。
7.50%氫氧化鉀溶液（W/V）
8.維生素A 標準液：視黃醇（純度85%）或視黃醇乙酸酯（純度90%）經皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A 標準品，使其濃度大約為1mL 相當于1mg 視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度.
9.維生素E 標準液: α-生育酚（純度95%），γ-生育酚（95%），δ-生育酚（純度95%）。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E 標準品，使其濃度大約為1mg/mL。臨用前用紫外分光光度分別標定此三種維生素E 的準確濃度。
10.內標溶液：稱取苯并[e]芘（純度98%），用脫醛乙醇配制成每5μg/mL 苯并［e］芘的內標溶液。
11.pHl－14試紙，
四、操作步驟
（一）樣品處理
1.皂化
稱取1～10g 樣品（含維生素A 約3ng，維生素E 各異構體約為40ng）于皂化瓶中，加30mL 無水乙醇，進行攪拌，直到顆粒物分散均勻為止。加5mL 10%抗壞血酸、苯并[e]芘標準液2.00mL，混勻。再加10mL50%氫氧化鉀，混勻。于沸水浴回流30min 使皂化*。皂化后立即放人冰水中冷卻。
2.提取
將皂化后的樣品移入分液漏斗中，用50mL 水分2~3次沖洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用約100mL yi醚分兩次洗皂化瓶及其殘渣，yi醚液并入分液漏斗中。輕輕振搖分液漏斗2min，靜置分層，棄去水層。
3.洗滌
用約100mL 水分次洗分液漏斗中的yi醚層，直至pH 試紙檢驗水層不顯堿性（zui初水洗輕搖，逐次振搖強度可增加）。
4.濃縮
將yi醚提取液經過無水鈉（約5g）濾入250～300mL 旋轉蒸發(fā)瓶內，用約50 mL yi醚沖洗分液漏斗及無水鈉3次，并入蒸發(fā)瓶內，并將其接至旋轉蒸發(fā)器上，于55℃水浴中減壓蒸餾并回收yi醚，待瓶中剩下約2mL yi醚時，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮氣吹掉yi醚。加入2.00 mL 乙醇，充分混合，溶解提取物。
5.離心
將乙醇液移入小塑料離心管中，3000rpm 離心5min。上清液供色譜分析。如果樣品中維生素含量過少，可用氮氣將乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容，并記下體積比。
（二）標準曲線的制備
1. 維生素A 和維生素E 標準濃度的標定方法
取維生素A 和各維生素E 標準液若干微升，分別稀釋至5.00 mL 乙醇中，并分別按給定波長測定各維生素的吸光值。用比吸光系數(shù)計算出該維生素的濃度。
2. 標準曲線的制備
本方法采用內標法定量。將一定量的維生素A、α-生育酚、β-生育酚、δ-生育酚及內標苯并[e]芘液混合均勻；選擇合適靈敏度，使上述物質的各峰高約為滿量程70%，為高濃度點。高濃度的1/2為低濃度點（其內標苯并［e］芘的濃度值不變）．用此種濃度的混合標準進行色譜分析。維生素標準曲線繪制是以維生素峰面積與內標物峰面積之比為縱坐標，維生素濃度為橫坐標繪制，或計算直線回歸方程。如有微處理機裝置，則按儀器說明用二點內標法進行定量。
本方法不能將β-E 和γ-E 分開，故γ-E 峰中包含有β-E 峰。
（三）液相色譜分析
1.色譜條件（推薦條件）
預柱：hypersil ODS 5μm，4mm×10cm；
分析柱：hypersil ODS 5μm，4.6mm×25cm ；
流動相：甲醇：水=98：2；混勻，于臨用前脫氣；
紫外鹼測器波長：300nm；量程0.02；
進樣量：20μL 進樣定量環(huán)；
流速： 1.65~1.70mL/min
2.樣品分析
取樣品濃縮液20μL，待繪制出色譜圖及色譜參數(shù)后，再進行定性和定量。
定性：用標準物色譜峰的保留時間定性。
定量：根據(jù)色譜圖求出某種維生素峰面積與內標物峰面積的比值，以此值在標準曲線上查到其含量?；蛴没貧w方程求出其含量。
五、計算
X=C/m×V×100/1000
X—某種維生素的含量（mg/100g）；
C—由標準曲線上查到某種維生素含量（μg/mL）；
V—樣品濃縮定容體積（mL）；
m：樣品質量（g）。
用微處理機二點內標法進行計算時．按其計算公式計算或由微機直接給出結果。結果的允許測定結果相對偏差值≤10%